Behandeling van gist in de brouwerij

BEHANDELING VAN GIST IN DE BROUWERIJ

Essentiële voedingsstoffen
Allereerst: Wat eten gistcellen eigenlijk? Hebben ze een voorkeur voor eten (het blijkt dat ze dat hebben!)? Gistcellen hebben de volgende soorten voedingsstoffen nodig om te kunnen groeien en delen:
• Een koolstofbron bv glucose.
• Een stikstofbron bv ammonium, aminozuren, peptiden. Vrije aminostikstof (FAN) wordt gedefinieerd als de som van alle individuele aminozuren, ammonium en di- en tripeptiden die in wort aanwezig zijn. Dit zijn de stikstofverbindingen die gistcellen tijdens fermentatie kunnen gebruiken. FANniveaus worden voornamelijk bepaald door het gebruikte mouttype en het maischproces. Wort gemaakt van hulpstoffen zoals sorghum hebben de neiging laag te zijn in FAN. Gist heeft een stikstofbron nodig om verschillende eiwitten (waaronder belangrijke enzymen) te kunnen synthetiseren en voor de aanmaak van hogere alcoholen, thiolen en esters.
• Mineralen bv. Mg²⁺, K⁺, Ca²⁺, Fe³⁺, Mn²⁺, Zn²⁺. Deze mineralen zijn nodig voor specifieke enzymactiviteiten. Mg²⁺ is bijvoorbeeld een cruciale cofactor van pyruvaatdecarboxylase, een enzym dat belangrijk is voor de omzetting van glucose in ethanol.
• Vitaminen bv. biotine. Biotine is een co-enzym bij veel fermentatiereacties, zoals bij carboxylering en decarboxylatiereacties.

Groei op verschillende koolstofbronnen
Wort bestaat voornamelijk uit vijf verschillende soorten suiker, namelijk: glucose, fructose, sucrose, maltose en maltotriose. Als je begint met gerstemout, ziet de typische suikersamenstelling van het wort er eigenlijk zo uit waarbij maltose de meest voorkomende suiker is en fructose de minst voorkomende suiker. Hebben gistcellen eigenlijk de voorkeur voor de ene suiker boven de andere? Het antwoord is ja. Gistcellen geven de voorkeur aan glucose boven één van de andere suikers in het wort. Dit betekent ook, dat ze eerst de glucose gaan eten en dan pas de andere suikers in het wort. De volgorde van voorkeur voor de verschillende suikers ziet er als volgt uit: de eerste voorkeurssuiker is glucose, dan fructose, dan sucrose, dan maltose dan maltotriose. Laten we eerst eens kijken hoe gistcellen deze verschillende suikers metaboliseren. Laten we ook eens nader bekijken hoe glucose wordt gemetaboliseerd.

Glucose wordt eerst in de cel getransporteerd, door transporters in het membraan. Nadat het in de cel is getransporteerd, wordt het gefosforyleerd om glucose-6-fosfaat te vormen in de eerste stap van een proces dat glycolyse wordt genoemd. Deze glycolyse leidt uiteindelijk tot de omzetting van de glucosesuiker in pyruvaat. Het pyruvaat wordt uiteindelijk omgezet in ethanol en CO₂ tijdens dit hele fermentatieproces, behalve de ethanol en CO₂ die worden gevormd, worden er ook twee ATP-moleculen geproduceerd per molecuul glucose en deze ATP-moleculen dienen eigenlijk als energiebron voor gistcellen. Interessant is dat gistcellen een andere manier hebben om deze ATP-moleculen te produceren, een proces dat ademhaling wordt genoemd.
Fructose volgt een vergelijkbaar traject als glucose, behalve dat het binnenkomt in de stap van fructose-6-fosfaat en het komt in deze stap in glycolyse.
Sucrose is een disacharide die bestaat uit glucose en fructose. Wel, er is een specifiek enzym dat invertase heet en dat kan de sucrose in glucose en fructose snijden. De glucose en fructose die op deze manier zijn gevormd, kunnen in de cel worden getransporteerd en gemetaboliseerd op dezelfde manier als we net hebben gezien voor glucose en fructose.
Maltose, ook een disacharide. bestaat uit twee glucosemoleculen. Het metabolisme van maltose is lichtjes anders dan het metabolisme van sucrose, in die zin dat, in het geval van maltose, de suiker eerst in de cel wordt getransporteerd en vervolgens in twee glucosemoleculen gesneden door een enzym genaamd maltase.

De groeicurve bestaat uit drie verschillende delen:
• een lag-fase,
• een exponentiële fase,
• een stationaire fase.
Dus wat gebeurt er in elk van deze fasen? Laten we eerst de lag-fase eens nader bekijken. Wanneer cellen worden geconfronteerd met een verandering in hun omgeving, wanneer ze bijvoorbeeld in wort worden gepitched, stoppen microben met delen en komen ze in een zogenaamde lag-fase. Deze vertragingsfase stelt cellen in staat zich aan te passen aan de nieuwe omstandigheden door het induceren van expressie van genen die nodig zijn voor groei in de nieuwe omgeving. Dus groeien ze niet zo veel in deze eerste fase. Na de lag-fase komen gistcellen in een fase van exponentiële groei, waar ze echt exponentieel groeien: ze verdubbelen om de zoveel minuten en ze consumeren de suiker. En ze zetten de suiker om in ethanol en kooldioxide en natuurlijk ook specifieke smaakstoffen. Ten slotte vertraagt de groei in stationaire fase. Je kunt zien dat de bevolkingsdichtheid niet echt zo groot meer is. Dat betekent echter niet dat de cellen niet meer metabolisch actief zijn. Ze kunnen nog steeds een aantal bijsmaken verwijderen. In deze stationaire fase kunnen gistcellen bezinken. Ze kunnen uitvlokken zoals je eerder in deze module hebt gezien. Dat is dus het geval wanneer gistcellen groeien in een zeer eenvoudige omgeving met slechts één koolstofbron aanwezig. Natuurlijk heb ik je net verteld dat het wort uit meerdere suikers bestaat. Dus, hoe groeien gistcellen op deze mix van suikers? Laten we voor het gemak eens kijken naar een mix van glucose en maltose. Glucose is de geprefereerde koolstofbron voor gist. Gistcellen beginnen dus met het consumeren van de glucose. De glucoseconcentratie zal na verloop van tijd dalen. Als ze uit een andere omgeving komen, zie je eerst een lag-fase in deze glucose gevolgd door een stadium van exponentiële groei van de glucose, hier metaboliseren ze eigenlijk de glucose. Dan raakt de glucose natuurlijk op en ze moeten hun metabolisme omzetten van glucose, die er niet meer is, om verder te gaan met de maltose. Wanneer ze dit doen, komen ze in een volgende vertragingsfase Als ze de genen hebben opgewekt die ze nodig hebben om op de maltose te groeien, dan komen ze in een nieuwe fase van exponentiële groei. Dus nu weet je wat meer over de verschillende suikers en hoe gist deze verschillende suikers metaboliseert.

Tijdsverloop van een fermentatie
• Ingisten: Het ingisten van wort gebeurt liefst zo snel mogelijk na de wortkoeling en -beluchting in de gistkuip en gebeurt met zetgist (inzaaigist). Wort is een ideaal substraat voor micro-organismen. Het zijn vooral de zgn. thermo-bacteriën die in belucht wort snel vermenigvuldigen en oorzaak zijn van de zgn. selderijsmaak. Snel ingisten zorgt voor een overwoekering van de eventueel aanwezige infecties.
• Hoeveelheid zetgist: Binnen de 12 à 16 uur moeten de eerste gistingsverschijnselen merkbaar zijn. Daartoe is een cel hoeveelheid van 15 à 20 miljoen cellen/ml ideaal. Vroeger sprak men van 0.5 – 1 l dik- brijïge gist per hl of 125- 250 g geperste gist per hl wort, maar deze benadering is zeer onnauwkeurig.

De hoeveelheid gist kan verminderd worden wanneer:
• het wort biologisch zeer zuiver is,
• de ingistingstemperatuur hoger is,
• beter belucht is,
• bij bovengisting,
• stofgist gebruikt wordt,
• de zetgist zeer vers en fysiologisch krachtig is,
• de zetgist goed gereinigd is en/of
• bij blonde wort of wort met een laag stamwortgehalte. En vice versa…
Men kan de hoofdgisting verkorten door meer gist toe te voegen, maar de hoeveelheid geoogste gist zal niet proportioneel stijgen.

Werkwijze:
Het ingisten gebeurt meestal met een doseerpomp rechtstreeks in de leiding, tussen wortkoeling en beluchting. Men kan ook de gist na het vullen van de gistkuip toevoegen, waarna men nog eens belucht, om de gist goed te mengen met het wort.

pH daling
Tijdens de gisting daalt de pH van het stamwort van 5,2 naar 4,3 – 4,6 voor jongbier en bier. Er worden immers organische zuren gevormd. In de gistcel zelf blijft de pH op 6,0. De grootste daling van de pH komt voort van de gistvermenigvuldiging, door het onttrekken van fosfaten en het onttrekken van ammoniak (dat basisch is) uit aminozuren. De pH afname vertraagt tijdens de laatste fase van de gisting.

Stikstofverbindingen
De stikstofverbindingen worden gewijzigd door:
• assimilatie van laagmoleculaire N-verbindingen, vooral aminozuren, voor de opbouw van cel eigen materiaal, vooral tijdens de gistgroei en de gistvermenigvuldiging,
• uitscheiding van hoogmoleculair eiwit door de pHdaling en de hierdoor veranderende oplossings- en ladingsverhouding,
• afgifte van de geassimileerde N door de gist.

Daling redoxpotentiaal
De redoxpotentiaal of rH (Dit is de verhouding tussen reducerende en oxiderende stoffen) van het wort daalt van 20 – 26 tot 8-12 in jongbier. De zuurstof in een biergisting is na maximum 24 uur volledig verbruikt.

Daling van het gehalte aan looi en bitterstoffen
Door de pH daling benaderen colloïdale hopbitterstoffen en polyfenolen meer hun iso-electrische pH, zodat zij kunnen neerslaan. Aan de grote oppervlakte van de CO₂ belletjes worden bitter- en looistoffen naar het schuimdek gevoerd en 20% ervan wordt aan het gistoppervlak geabsorbeerd. Deze gist smaakt dus sterk bitter! In totaal daalt het gehalte aan hopbitterstoffen met 40 – 50%, terwijl looistoffen met 20 – 30 % afnemen. Dit is een voordeel voor de colloïdale stabiliteit van het bier.

Kleurvermindering
De EBC-kleur van het wort daalt door de pH daling, het uitscheiden van melanoidinen, looi- en kleurstoffen in het schuimdek en absorptie door de gist. De kleur vermindert doorgaans met ca. 3 EBC eenheden.

Introductie tot gistaroma's
Tijd om te ontdekken hoe gist ook het smaakprofiel van een bier bepaalt! Gist produceert niet alleen ethanol en CO₂. Het gistmetabolisme zorgt ook voor veel verschillende aroma's die bijdragen aan de typische smaken van een bier. Enkele algemene klassen van verbindingen en hun aroma's/effecten worden hieronder opgesomd:

Organische zuren
Organisch zuur, aldehyde en hogere alcoholproductie zijn nauw verbonden in het gistmetabolisme, via de Ehrlich-route. Deze route bestaat uit drie stappen die aminozuren modificeren, de belangrijkste stikstofbron bij veel fermentaties. Deze stappen worden weergegeven in de onderstaande afbeelding.
Aminozuren zijn:
1. gedeamineerd,
2. gedecarboxyleerd (afgifte van CO₂),
3. gereduceerd tot hogere alcoholen.

Op deze manier kunnen gistcellen de essentiële stikstof (= de aminozuren) die aanwezig zijn in het fermentatiemedium (wort) gebruiken en in ruil daarvoor ook aparte aromacomponenten produceren.

Organische zuren kunnen worden gevormd via de volgende hoofdroutes:
• Ehrlich-route (vorming van zogenaamde alfa-ketozuren),
• koolhydraat-metabolisme.
Organische zuren hebben over het algemeen een zure smaak. De belangrijkste organische zuren die bijdragen aan het bieraroma zijn:

Factoren die het gehalte aan organische zuren beïnvloeden. Vanwege het complexe samenspel met aldehyden en hogere alcoholen, is het erg moeilijk om het niveau van organische zuren tijdens fermentatie te sturen.

Aldehyden
Aldehyden kunnen worden gevormd via: Ehrlich-padKoolhydraatmetabolisme (zie hieronder voor meer informatie over hoe acetaldehyde wordt gevormd). Daarnaast kunnen ook aldehyden worden gevormd via de volgende reacties:
• Lipide-oxidatie.
• Strecker-afbraak van aminozuren.
De laatste twee zijn voorbeelden van reacties die optreden tijdens het verouderingsproces van bier en die kunnen leiden tot aanzienlijke bijsmaken. Over het algemeen wordt aangenomen dat aldehyden een onaangenaam, grasachtig aroma hebben.

De belangrijkste aldehyden die bijdragen aan het bieraroma zijn:

Factoren die het aldehydegehalte beïnvloeden.
Acetaldehyde is het belangrijkste aldehyde dat wordt gevormd tijdens de fermentatie. Het kan worden gevormd via de Ehrlich-route (alanine → pyruvaat → acetaldehyde) of als een regulier tussenproduct bij alcoholische fermentatie (dus via koolhydraatmetabolisme, namelijk pyruvaat → acetaldehyde → ethanol). Aceetaldehyde is verantwoordelijk voor de kelder of het muffe aroma dat wordt geassocieerd met jong, groen bier. Het aceetaldehydegehalte in groene bieren schommelt rond de 20-40 mg/l; terwijl in afgewerkte bieren het aceetaldehydegehalte in het algemeen rond de 8-10 mg/l ligt.

Hogere alcoholen
Hogere alcoholen, ook wel foezelalcoholen genoemd, worden doorgaans gevormd door de gistcellen uit aminozuren via de Ehrlich-route (katabole route). De onderstaande afbeelding geeft een schematisch overzicht van de verschillende stappen van aminozuur tot hogere alcohol in het Ehrlich-pad. Het tweede cijfer geeft een meer gedetailleerd overzicht van specifieke aminozuren en hun respectievelijke hogere alcoholen.

Algemeen overzicht van chemische reacties in Ehrlich-route

Hogere alcoholen versterken de alcoholische smaak van bier en geven het bier een verwarmend karakter. Een hoger niveau van foezelalcoholen leidt tot zwaardere bieren; terwijl een laag gehalte aan foezelalcoholen resulteert in een schoon en droog bier. Belangrijk is dat hogere alcoholen als voorlopers van esters dienen (zie volgend deel) en op deze manier ook het bieraroma kunnen beïnvloeden. Hieronder vindt u een overzicht van de typische hogere alcoholen die worden gevormd tijdens de gisting, samen met hun typische aroma en typische niveaus die worden aangetroffen in bieren van lage en hoge gisting.

Esters
Esters vormen de grootste groep aroma-actieve stoffen in bier. Esters worden gevormd in gistcellen via een reactie tussen acetyl- of acyl-CoA en een alcohol. De eerste klasse van esters, gevormd door condensatie van acetyl-CoA en een alcohol, worden acetaatesters genoemd. De tweede klasse van esters, gevormd door condensatie van acyl-CoA en ethanol, worden ethylesters van vetzuren genoemd. Acetaatesters diffunderen gemakkelijker over het plasmamembraan en hebben op deze manier een grotere invloed op het uiteindelijke bieraroma.

De tabel toont enkele van de esters die tijdens de fermentatie door gistcellen worden geproduceerd.

Factoren die het gehalte aan esters beïnvloeden
Het niveau en type van de gevormde esters zijn sterk afhankelijk van de spanning. Daarnaast zijn er veel verschillende factoren die de productie van esters kunnen beïnvloeden. Vanwege de complexiteit van enzymregulatie en substraatbeschikbaarheid is het exacte resultaat van het veranderen van één specifieke parameter in het brouwproces nog steeds moeilijk te voorspellen.

Temperatuur
Hogere temperaturen stimuleren de groei van gist en stimuleren ook enzymatische activiteiten. Dit leidt tot een verhoogd gehalte aan esters.

Zink (Zn²⁺)
Zink resulteert in verhoogde niveaus van hogere alcoholen en dus ook in verhoogde esterspiegels. Hoge zwaartekracht verhoogt het esterniveau.

Zuurstof (O₂)
Zuurstof remt de enzymen die betrokken zijn bij de synthese van esters.

Druk
Verhoogde druk resulteert in verlaagde esterniveaus. Dit komt doordat de hogere druk de enzymen remt die verantwoordelijk zijn voor het synthetiseren van de voorlopers van esters.

Bron: (Avond)opleidingen universiteit van Leuven & Gent.
Beschikbaar gesteld aan De Roerstok, door Marc Vriens.